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Amicon® Ultra超濾管 | 使用過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題

更新時(shí)間：2024-07-25 瀏覽次數(shù)：1343

之前我們有幾期文章介紹了使用默克Amicon® Ultra超濾管的應(yīng)用場(chǎng)景（分離外泌體、濃縮病毒），有很多老師反饋了一些超濾管使用時(shí)的問(wèn)題，針對(duì)其中問(wèn)的比較多的問(wèn)題，小編特意進(jìn)行了收集、整理。今天給大家介紹超濾管的使用過(guò)程中，離心力g與RPM的換算及常見(jiàn)問(wèn)題的解答。

01
離心力g與RPM的換算

 

01

 測(cè)量轉(zhuǎn)子的半徑

從離心機(jī)廠(chǎng)家文件上查閱轉(zhuǎn)子半徑，或像以下圖示這樣自己測(cè)量轉(zhuǎn)子半徑。

640.webp.jpg

02

 采用列線(xiàn)圖計(jì)算RPM


繪制轉(zhuǎn)子半徑和建議的RCF（離心力g）圖，連線(xiàn)確定RPM。

640.webp (1).jpg

此列線(xiàn)圖實(shí)際是通過(guò)右側(cè)的公式計(jì)算得出的。

 

640.webp (2).jpg

02
Amicon® Ultra超濾管-常見(jiàn)問(wèn)題解答

 

Q1：Amicon® Ultra超濾管的膜材質(zhì)是什么？

A1：Amicon® Ultra超濾管的膜材質(zhì)為默克密理博Ultracel®再生纖維素膜，生產(chǎn)工藝嚴(yán)格，截留分子量明確而精準(zhǔn)，蛋白吸附損失最小。

 

Q2：如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，那么這兩個(gè)蛋白的大小需要相差多少？

A2：按照經(jīng)驗(yàn)，建議兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10倍）。

 

Q3：Amicon® Ultra超濾管可以用于病毒濃縮么？

A3：可以。對(duì)于慢病毒推薦Amicon® Ultra 100 kDa； 對(duì)于腺病毒推薦Amicon® Ultra 50kDa。具體的操作步驟可以參考病毒濃縮純化試劑盒FTLV00003和FTAV00003的產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。另提供AAV（腺相關(guān)病毒）的制備方法供參考。

 

Q4： Amicon® Ultrar超濾管可以用酒精消毒滅菌么？

A4：Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的，但是對(duì)滅菌處理的具體方法沒(méi)有做相關(guān)的測(cè)試，所以無(wú)法提供更進(jìn)一步的參考信息。建議采用Ultrafree無(wú)菌離心管對(duì)濃縮后的樣品進(jìn)行過(guò)濾除菌。

 

Q5：Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？

A5：Amicon® Ultra都是采用熱封設(shè)計(jì)，不可以用高壓高溫滅菌。

 

Q6：Amicon® Ultra超濾管是否不含RNA酶？

A6：不保證超濾管不含RNA酶，建議用0.1% DEPC在37度浸泡2h，以滅活RNA酶；殘留的DEPC可以用Milli-Q®超純水洗滌除去。

 

Q7：用Amicon® Ultra超濾管去除去污劑是有什么需要注意的嗎？

A7：去污劑因其性質(zhì)，當(dāng)濃度大于臨界微團(tuán)濃度（Critical Micelle Concentration, CMC）時(shí)，去污劑分子會(huì)聚集形成微團(tuán)而改變分子構(gòu)象，這有可能會(huì)影響去污劑的去除效果。

 

Q8：蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？

A8：蛋白如果濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過(guò)20mg/ml。對(duì)于對(duì)濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進(jìn)方法是：

  • 離心力降為推薦離心力的30%-50%；

  • 改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時(shí)可以選擇30k）；

  • 在濃縮過(guò)程中取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮；

  • 體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉淀的發(fā)生。

Q9：有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來(lái)，可能是什么原因？

A9： Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。 如果出現(xiàn)這種情況，請(qǐng)先用0.1N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。

 

Q10：說(shuō)明書(shū)中推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進(jìn)行離心？
A10：可以，但是低溫會(huì)增加蛋白樣品的粘性，導(dǎo)致流速減慢，建議可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到原來(lái)的1.5倍。

 

Q11：濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒(méi)有目的蛋白，可能的原因有哪些？
A11：首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請(qǐng)確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。其次，如果問(wèn)題仍然出現(xiàn)，請(qǐng)不要丟棄樣本濾過(guò)液以便用于分析可能的原因：
· 如果目的樣本在濾過(guò)液中，那么請(qǐng)排查：
a）是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？
b）使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請(qǐng)換算成相應(yīng)的g離心力，具體換算方法請(qǐng)垂詢(xún)。
c）離心機(jī)最近是否有校準(zhǔn)過(guò)？
d）是否shou次嘗試這個(gè)蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對(duì)其它蛋白成功操作的話(huà)，那么有可能是這個(gè)目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時(shí)可以選擇10k）。
· 如果目的樣本也不在濾過(guò)液中，那么：
a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL？
b）用來(lái)確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？
c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請(qǐng)參考上面的關(guān)于蛋白沉淀問(wèn)題的解釋。


Q12：如何對(duì)超濾管進(jìn)行去除內(nèi)毒素的處理？
A12：提供的超濾管是沒(méi)有經(jīng)過(guò)去內(nèi)毒素處理的，同時(shí)由于內(nèi)毒素通常以多聚體的形式存在，大小在10-1000KD之間不等，在超濾的過(guò)程中是無(wú)法去除的。可在實(shí)驗(yàn)前通過(guò)先用0.5MNaOH預(yù)清洗，隨后用Milli-Q®水/緩沖液清洗的步驟去除大部分內(nèi)毒素。關(guān)于針對(duì)Amicon®、Microcon®、Centricon®嘗試過(guò)的內(nèi)毒素去除方案。


Q13：用濃縮后的蛋白做下游分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有干擾，可能有哪些原因？
A13：Amicon®Ultra超濾膜含有微量甘油。如果此成分干擾分析，可用緩沖液或Milli-Q®水預(yù)清洗。如果干擾仍然存在，用0.1NNaOH清洗，然后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。


Q14：懷疑濃縮過(guò)程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？
A14：Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附zui低的超濾膜。但是對(duì)于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)。對(duì)于這種情況，可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對(duì)超濾管進(jìn)行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附。

 


 

 

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